|
Οι λεϊσμανιάσεις, ομάδα ασθενειών που μεταδίδονται από την σκνίπα, προκαλούνται από διάφορα είδη του παράσιτου Leishmania και εμφανίζουν ένα ευρύ φάσμα κλινικών εκδηλώσεων, η σοβαρότητα των οποίων ποικίλλει. Μερικές μορφές της ασθένειας, όπως η σπλαχνική λεϊσμανίαση (kala-azar) μπορούν να επιφέρουν ακόμη και τον θάνατο αν δεν χορηγηθεί έγκαιρα θεραπευτική αγωγή. Θεωρούνται ασθένειες εξέχουσας σπουδαιότητας για τη Δημόσια Υγεία και μεγάλης κοινωνικο-οικονομικής σημασίας. Στη χώρα μας αναφέρονται περίπου 50 περιστατικά σπλαχνικής λείσμανίασης το χρόνο. Η μόλυνση του σκύλου, δεξαμενή του παράσιτου φτάνει το 34% στις ενδημικές περιοχές όπως η Αττική. Όμως οι αριθμοί αυτοί πιθανότατα δεν απεικονίζουν την πραγματικότητα αφού η καταγραφή των περιστατικών παρ’ όλο που είναι υποχρεωτική δεν είναι συστηματική.
Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας, θεωρεί επιτακτική ανάγκη την ανάπτυξη νέων μη τοξικών φαρμάκων και την παρασκευή εμβολίου για τον έλεγχο του συνεχώς αυξανόμενου αριθμού των κρουσμάτων από Λεϊσμανίαση. Επίσης θεωρείται εξέχουσας σημασίας η ανάπτυξη αξιόπιστων και ευαίσθητων διαγνωστικών εργαλείων/μεθόδων για την ανίχνευση του παράσιτου στα πρώτα στάδια της μόλυνσης. Οι ερευνητικοί άξονες του εργαστηρίου, με απώτερο στόχο τη συμβάολή προς αυτή την κατεύθυνση, εστιάζονται στα ακόλουθα:
1. ΚΑΤΑΝΟΗΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΠΟΥ ΕΜΠΛΕΚΟΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ: ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΗ
Kαθορισμός παραγόντων του παθογόνου που εμπλέκονται στη μολυσματικότητα/παθογένεια
Μελετάμε μόρια που παίζουν σημαντικό ρόλο στον κύκλο ζωής του παρασίτου όπως η συνδετική ιστόνη H1 και η λεΐσμανιακή Ran πρωτεΐνη της υπεροικογένειας Ras. Για τον σκοπό αυτό κατασκευάζονται «ανασυνδυασμένα» παράσιτα σε διάφορα είδη Leishmania τα οποία είτε υπερεκφράζουν την υπό μελέτη πρωτείνη είτε έχουν διαγεγραμμένο το ενδογενές γονίδιο, με ομόλογο ανασυνδυασμό. Τα «ανασυνδυασμένα» παράσιτα χρησιμοποιούνται σε in vitro και in vivo πειράματα για να καθοριστεί ο ρόλος που διαδραματίζουν οι υπό μελέτη πρωτεΐνες στη μολυσματικότητα των παρασίτων.
Με την προσέγγιση αυτή δείξαμε ότι υπερέκφραση της λεΐσμανιακής ιστόνης Η1 σε παράσιτα L.donovani μειώνει σημαντικά την μολυσματικότητα των παρασίτων in vitro (μόλυνση μακροφάγων) ενώ τα παράσιτα που υπερεκφράζουν την ιστόνη H1 είναι μη μολυσματικά in vivo. Επίσης, ο κυτταρικός κύκλος των παρασίτων επηρεάζεται από την υπερέκφραση του μορίου με αποτέλεσμα να καθυστερούν να μπουν και να ολοκληρώσουν την S φάση.. Επιπλέον καθυστερούν να ολοκληρώσουν τη διαφοροποίησή τους στην αμαστιγωτή μορφή, με αποτέλεσμα να σκοτώνονται από τα μακροφάγα (Smirlis et al, 2006).
Για περαιτέρω μελέτη των αλλαγών που συμβαίνουν στα παράσιτα με υπερέκφραση της λεΐσμανιακής ιστόνης Η1 συγκρίνουμε τα πρωτεώματα «ανασυνδυασμένων» παρασίτων ελέγχου και αυτών που υπερεκφράζουν την ιστόνη Η1 με ηλεκτροφόρηση 2 διαστάσεων ακολουθούμενη από φασματοσκοπία μάζας.
Ο μηχανισμός ρύθμισης της έκφρασης των ιστονών αποτελεί επίσης αντικείμενο μελέτης του εργαστηρίου. Τα επίπεδα των ιστονών στα μετάζωα ρυθμίζονται σύμφωνα με τον κυτταρικό κύκλο. Κύριο ρυθμιστικό ρόλο σε αυτό τον μηχανισμό έχει η πρωτεΐνη SLBP (stem-loop binding protein) η οποία αλληλεπιδρά με μια δομή “stem-loop” στο mRNA των μεταγράφων των ιστονών. Ο μηχανισμός ρύθμισης των ιστονών της Leishmania φαίνεται να έχει κοινά χαρακτηριστικά με αυτό των μεταζώων. Έχουμε χαρακτηρίσει μια αντίστοιχη δομή “stem-loop” στα μετάγραφα των λεϊσμανιακών ιστονών που φαίνεται να εμπλέκεται στην ρύθμιση των επιπέδων τους. Η πρωτεΐνη SLBP του παρασίτου έχει κλωνοποιηθεί και μελετάμε την αλληλεπίδραση της με την δομή “stem-loop”, αλλά και γενικότερα το βιολογικό της ρόλο στο παράσιτο.
Η πρωτεΐνη Ran της υπεροικογένειας Ras, είναι μια GTPάση που στα ανώτερα θηλαστικά συμμετέχει σε διαδικασίες όπως τη μεταφορά πρωτεΐνών από τον κυτταρόπλασμα στον πυρήνα και αντίστροφα, στη δημιουργία της πυρηνικής μεμβράνης και της μιτωτικής ατράκτου και ελέγχει την S φάση του κυτταρικού κύκλου και το μιτωτικό σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου. H λεΐσμανιακή Ran έχει κλωνοποιηθεί στο εργαστήριο και γίνεται μελέτη του ρόλου της στη φυσιολογία του παρασίτου.
Μελέτη των μηχανισμών φαγοκυττάρωσης της Leishmania από ουδετερόφιλα και μακροφάγα
(Υπεύθυνος, Δρ. Χ. Μπολέτη)
Το πρώτο βήμα στην αλληλεπίδραση του παρασίτου Leishmania με τον ξενιστή, μετά το τσίμπημα της σκνίπας, είναι η είσοδός του με φαγοκυττάρωση και η εγκαθίδρυση του σε κύτταρα ξενιστές του ανοσοποιητικού συστήματος των θηλαστικών που είναι κατά κύριο λόγο τα μακροφάγα,τα ουδετερόφιλα και τα δενδριτικά κύτταρα. Στα κύτταρα αυτά το παράσιτο κατορθώνει να επιβιώσει τροποποιώντας μοριακούς μηχανισμούς σηματοδότησης και επιφέροντας αλλαγές σε φυσιολογικές διεργασίες του κυττάρου όπως η φαγοκυττάρωση, η ωρίμανση του παρασιτόφορου φαγοσώματος, και η απόπτωση.
Οι μελέτες μας εστιάζονται :
- στην κατανόηση μοριακών μηχανισμών φαγοκυττάρωσης της Leishmania από τα μακροφάγα και τα ουδετερόφιλα κύτταρα και ειδικότερα στον ρόλο των φωσφοινοσιτιδίων PI3P και PI(4,5)P2 και ενζύμων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό τους στην φαγοκυττάρωση και ωρίμανση των Λεϊσμανιοφόρων φαγοσωμάτων στα αρχικά στάδια της μόλυνσης.
- στην μελέτη μολυσματικών παραγόντων (virulence factors) του παρασίτου που εμπλέκονται στην τροποποίηση του Λεϊσμανιόφορου φαγοσώματος και την επιβίωση του παρασίτου σε αυτό.
Οι ανωτέρω μελέτες στοχεύουν στην καλύτερη κατανόηση των αρχικών σταδίων της εγκαθίδρυσης της μόλυνσης αλλά και στην ταυτοποίηση νέων εν δυνάμει μοριακών στόχων για την ανάπτυξη φαρμάκων.
Για την μελέτη της πορείας της φαγοκυττάρωσης σε ουδετερόφιλα και μακροφάγα κύτταρα και την in vivo απεικόνιση των σταδίων της με time-lapse μικροσκοπία φθορισμού και συνεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιούνται γενετικά τροποποιημένα παράσιτα L. donovani και L.major που εκφράζουν τις φθορίζουσες πρωτεΐνες GFP και RFP, κυτταρικές σειρές πρότυπα μακροφάγων (Raw264.7, THP1) και ουδετεροφίλων (HL60) καθώς και φαγοκύτταρα απομονωμένα από μυελό των οστών ποντικού ή από ανθρώπινο αίμα.
|
| Φωτογραφία από συνεστιακό μικροσκόπιο. Κόκκινο: κυτταροσκελετός ακτίνης; Πράσινο: παράσιτο GFP-L.donovani |
2. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ ΤΗΣ ΣΥΝΘΕΤΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΛΥΚΟΓΟΝΟΥ (GSK-3) ΚΑΙ ΤΗΣ ΑΝΤΙΠΑΡΑΣΙΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΑΠΩΤΕΡΟ ΣΚΟΠΟ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΝΕΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΥΨΗΛΗΣ ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΕΝΑΝΤΙ ΜΟΡΙΩΝ-ΣΤΟΧΩΝ
Ειδικότερα, μελετάμε την αντιλεϊσμανιακή δράση αναλόγων της ιντιρουμπίνης που στοχεύουν και αναστέλλουν τις κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες των θηλαστικών (CDKs) και την κινάση της συνθετάσης του γλυκογόνου (GSK-3). Η λεϊσμανιακή GSK-3 κλωνοποιηθήκε στο εργαστήριο και μελετάμε αν θα μπορούσε να αποτελέσει μόριο-στόχος των ιντιρουμπινών. Η μελέτη της αντιλεϊσμανιακή δράσης της 10-δεακέτυλο-μπακατίνης ΙΙΙ, πρόδρομο μόριο της ταξόλης, απετέλεσε επίσης αντικείμενο μελέτης στο εργαστήριο. Η αντιλεϊσμανιακή δράση των διαφόρων ουσιών καθορίζεται in vitro έναντι και των δύο μορφών Leishmania (της προμαστιγωτής και της ενδοκυτταρικής αμαστιγωτής).
Η μελέτη της ευαισθησίας κλινικών στελεχών στα φάρμακα που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία είναι επίσης αντικείμενο μελέτης στο εργαστήριο.
3. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΩΝ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗΣ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΓΙΑ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ
Για την διάγνωση της λεϊσμανίασης γίνεται μια προσπάθεια ανάπτυξης μιας εύχρηστης, γρήγορης και ευαίσθητης τεχνικής που περιλαμβάνει την ενίσχυση γονιδιακών περιοχών του παρασίτου με PCR και στην συνέχεια την ανίχνευση των προϊόντων με χρήση μοριακής ταινίας
Οι μελέτες που ασχολούνται με την επιδημιολογία της λεισμανίασης στην χώρα μας είναι περιορισμένες. Τα περιστατικά δερματικής λεϊσμανίασης που αναφέρονται οφείλονται και στις μέρες μας στο είδος L. tropica, ενώ για την σπλαχνική λεϊσμανίαση υπεύθυνο είναι το είδος L. infantum. Εκτός του κυρίαρχου στην Ευρώπη υποείδους ΜΟΝ-1 η τυποποίηση μιας ομάδας στελεχών, που απομονώθηκαν από ανθρώπους και σκύλους στην Αθήνα και την Κρήτη, με ισοενζυμική πολυεστιακή ηλεκτροφόρηση (ΜLEE, Multilocus Enzyme Electrophoresis) ανίχνευσε σε μεγάλο ποσοστό (29.3 %) το υποείδος ΜΟΝ-98, το μεγαλύτερο που έχει αναφερθεί διεθνώς.
Για την τυποποίηση και πληθυσμιακή μελέτη των στελεχών χρησιμοποιούνται μοριακές τεχνικές υψηλής διακριτικής ικανότητας Ειδικότερα αναπτύξαμε μία μέθοδο τυποποίησης που βασίζεται στην ενίσχυση του γονιδίου Κ26. Η μέθοδος είναι ειδική για τα είδη L. infantum και L. donovani τα οποία και διαχωρίζει βάση του μεγέθους/αλληλουχίας αυτού το γονιδίου. Για τη μελέτη της πληθυσμιακής δομής των στελεχών χρησιμοποιούμε την πολυεστιακή τυποποίηση με τη χρήση μικροδορυφορικών αλληλουχιών (MLMT). Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιείται μια ομάδα δεικτών (14 μικροδορυφορικές αλληλουχίες) που είναι πολυμορφικοί στα στελέχη ΜΟΝ-1.
|