Εισαγωγή

Τα νοσήματα του θυρεοειδούς, κυρίως η θυρεοειδίτιδα Hashimoto και η νόσος του Graves, παρουσιάζουν διεθνώς μεγάλο ενδιαφέρον, αφού είναι ευρέως διαδεδομένα, ιδιαίτερα μετά την καταστροφή του Chernobyl, στο γενικό πληθυσμό. Επιπρόσθετα, η θυρεοειδική νόσος έχει υψηλή νοσηρότητα καθώς μεγάλος αριθμός ασθενών χρειάζεται συνήθως να παίρνει θυροξίνη εφ’όρου ζωής και να βρίσκεται υπό συνεχή παρακολούθηση. Αυτό αυξάνει κατά πολύ το κόστος της υγειονομικής περίθαλψης και έτσι είναι επιτακτική ανάγκη η εξεύρεση νέων μεθόδων που θα διευκολύνουν την έγκαιρη διάγνωση και πρόληψη της ασθένειας. Σε επίπεδο βασικής έρευνας, η αυτοάνοση θυρεοειδίτιδα μπορεί να χρησιμεύσει σαν ένα εξαιρετικό μοντέλο αυτοάνοσης οργανοειδικής νόσου και να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη δυσλειτουργιών στην ανοσορρύθμιση που καταλήγουν στην ανάπτυξη αυτοδραστικών T λεμφοκυττάρων (υποθυρεοειδισμός) ή αυτοαντισωμάτων με παθογονική δράση (υπερθυρεοειδισμός). Η χρήση ζωικών μοντέλων αυτοάνοσης θυρεοειδίτιδας για τη μελέτη της οργανοειδικής αυτοάνοσης νόσου προσφέρει σημαντικά πλεονεκτήματα, αφού ο αδένας είναι εύκολα προσιτός και τα κύρια αυτοαντιγόνα γνωστά. Στην Ελλάδα, το Εργαστήριό μας είναι το μοναδικό εργαστήριο που ασχολείται με τη μελέτη των αυτοάνοσων νοσημάτων του θυρεοειδούς σε ζωικά μοντέλα, σε συνεργασία με τον καθηγτή Γ. Καραγιαννιώτη (Νέα Γη, Καναδάς).
Ο βασικός στόχος των ερευνητικών δραστηριοτήτων του εργαστηρίου είναι η μοριακή ανάλυση του κύριου αυτοαντιγόνου του αδένα, της θυρεοσφαιρίνης (προσδιορισμός Β- και Τ-επιτόπων) καθώς και η ανάπτυξη ζωικών μοντέλων των ανθρώπινων νοσημάτων με απώτερο σκοπό την κατανόηση της αιτιοπαθογένειας των αυτοάνοσων νοσημάτων του θυρεοειδούς και την ανάπτυξη αντιδραστηρίων και μεθόδων για την έγκαιρη διάγνωση και αντιμετώπισή τους.

1. Χαρακτηρισμός Β-επιτόπων στο μόριο της θυρεοσφαιρίνης
H θυρεοσφαιρίνη (Tg), που αποτελεί ένα από τα κύρια αυτοαντιγόνα του αδένα, είναι μια μεγάλου μεγέθους (ομοδιμερής, 660 kDa) γλυκοπρωτεΐνη και η χαρτογράφηση των επιτόπων της που αναγνωρίζονται από Τ και Β λεμφοκύτταρα είναι ιδιαίτερα δύσκολο να πραγματοποιηθεί. Μέχρι σήμερα δεν έχουν χαρακτηριστεί κυρίαρχοι ή επικρατείς (dominant) επίτοποι, ούτε στο Β- αλλά ούτε και σε Τ-επίπεδο.
Όσον αφορά στα πεπτίδια της Tg που φέρουν Β-επιτόπους, σε προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου, έχουν προσδιοριστεί τρία 20πεπτίδια της ανθρώπινης Tg (2340-2359), (2472-2491), (2652-2671) τα οποία αναγνωρίζονταν από αυτοαντισώματα προερχόμενα από ορούς ασθενών, είτε με νόσο Graves είτε με θυρεοειδίτιδα Hashimoto. Στη συνέχεια, μελετήθηκε κατά πόσο τα τρία αυτά πεπτίδια αναγνωρίζονταν από αντισώματα που επάγονται σε πειραματόζωα μετά από πειραματική ανοσοποίηση με Tg. Ένα από αυτά, το πεπτίδιο (2472-2491) κατάφερε να επάγει την παραγωγή αντισωμάτων σε κουνέλια. Επιπλέον, κατά την ανοσοποίηση με αυτό το πεπτίδιο διαπιστώθηκε ενδομοριακή και διαμοριακή επέκταση επιτόπων (δηλ. παραγωγή αντισωμάτων έναντι άλλων επιτόπων της Tg ή έναντι άλλων αντιγόνων). Σήμερα η προσπάθεια για ανίχνευση πεπτιδίων που να αποτελούν στόχο αυτοαντισωμάτων σε ορούς ασθενών με θυρεοειδίτιδα Hashimoto συνεχίζεται, με απώτερο στόχο τη χρήση τους κυρίως για διαγνωστικούς σκοπούς.

2. Ανάπτυξη πειραματικής αυτοάνοσης θυρεοειδίτιδας (ΕΑΤ)/ τ-επίτοποι στο μόριο της θυρεοσφαιρίνης

Η θυρεοειδίτιδα Hashimoto χαρακτηρίζεται από διήθηση και καταστροφή του θυρεοειδή αδένα από αυτοδραστικά Τ λεμφοκύτταρα. Η αυτοάνοση θυρεοειδίτιδα (experimental autoimmune thyroiditis/ΕΑΤ) που επάγεται από την ανοσοποίηση ποντικών με ολόκληρο το μόριο της Τg ή με πεπτίδια αυτής, μιμείται την ανθρώπινη νόσο. Μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί μόνο δεκατρείς (13) παθογονικοί επίτοποι της Tg του ποντικού που αναγνωρίζονται από Τ λεμφοκύτταρα και έχουν όλοι χαρακτηριστεί ως μη επικρατείς (non immunodominant). Η ΕΑΤ είναι γενετικά ρυθμιζόμενη από το σύμπλεγμα Η-2. Φυλές με απλότυπο Η-2k και Η-2s χαρακτηρίζονται ευαίσθητες (high responders) ως προς την επαγωγή ΕΑΤ με ολόκληρο το μόριο της Tg, ενώ φυλές με Η-2b και Η-2d απλότυπο χαρακτηρίζονται ως ανθεκτικές (low responders). Στόχος μας είναι να προσδιορίσουμε νέα πεπτίδια  της Tg, τα οποία θα φέρουν Τ-επιτόπους. Όσον αφορά στα πεπτίδια της Tg που φέρουν παθογονικούς Τ-επιτόπους, σε προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου διαπιστώθηκε ότι ένα από τα τρία πεπτίδια που αναγνωρίζονταν από ορούς ασθενών με αυτοάνοσα νοσήματα του θυρεοειδούς, το (2340-2359)/p2340, περιείχε αλληλουχίες που πιθανά συνδέονται με Ek MHC μόρια και αποτελούν Τ-επιτόπους, γεγονός που επιβεβαιώθηκε πειραματικά. Επιπλέον, βρέθηκε ότι το p2340 είναι παθογονικό (επάγει ΕΑΤ) στη φυλή ποντικών AKR/J (απλότυπου H-2k). Δεδομένου ότι τα Εk MHC μόρια τάξης ΙΙ του ποντικού είναι ανάλογα των DR3 μορίων του ανθρώπου, εξετάστηκε παράλληλα αν το p2340 είναι παθογονικό σε διαγονιδιακά ποντίκια τα οποία εκφράζουν DR3 MHC μόρια. Πράγματι, μετά από ανοσοποίηση των διαγονιδιακών ποντικών με το πεπτίδιο αυτό εκδηλώθηκε ΕΑΤ. Στη συνέχεια, συσχετίστηκε η παθογονικότητα του p2340 με άλλους MHC απλοτύπους. Για πρώτη φορά βρέθηκε παθογονικό πεπτίδιο να επάγει ΕΑΤ όχι μόνο σε ευαίσθητες φυλές ποντικών (AKR/J και CBA/J [H-2k], SJL/J [H-2s])  αλλά και σε μια ανθεκτική φυλή ποντικών  (BALB/c [H-2d]). Στα μελλοντικά σχέδια του εργαστηρίου συμπεριλαμβάνεται η εύρεση της ελάχιστης αλληλουχίας που ορίζει τον Τ-επίτοπο που περιέχεται στο p2340, ώστε να διαπιστωθεί αν είναι ο ίδιος επίτοπος που παρουσιάζεται από τα διαφορετικά μόρια MHC ή όχι και να συσχετιστεί η θέση του με αυτή του Β-επιτόπου που φέρει.

Η νόσος του Graves (GD) χαρακτηρίζεται από την παθογονική δράση αυτοαντισωμάτων έναντι του υποδοχέα της ορμόνης θυρεοτροπίνης (TSH-R) στην επιφάνεια των θυρεοειδικών κυττάρων. Αυτά τα αντισώματα μιμούνται τη δράση της ορμόνης, οδηγώντας συχνά σε υπερδιέγερση των θυρεοκυττάρων και αυξημένη παραγωγή και έκκριση θυροξίνης στην κυκλοφορία. Μέχρι σήμερα δεν έχει αναπτυχθεί πειραματικό μοντέλο που να αναπαράγει σταθερά τα περισσότερα συμπτώματα της ανθρώπινης νόσου, κυρίως λόγω του ότι ο TSH-R εκφράζεται στα θυρεοειδικά κύτταρα σε χαμηλή συγκέντρωση και δεν είναι εύκολο να απομονωθεί σε μεγάλες ποσότητες, απαραίτητες για μελέτες σε ζώα. Αυτό το πεδίο έρευνας παρουσιάζει διεθνές ενδιαφέρον και είναι ιδιαίτερα ανταγωνιστικό. Η στρατηγική που ακολουθείται είναι η ενδοδερμική ανοσοποίηση ποντικών με το γονίδιο (naked DNA) του υποδοχέα της θυρεοτροπίνης (TSH-R) (χρήση πλασμιδίων που φέρουν το γονίδιο του υποδοχέα της TSH του ανθρώπινου ή που φέρουν μαζί και γονίδια που κωδικοποιούν κυτταροκίνες ή για συνδιεγερτικά μόρια). Η μέθοδος αυτή υπερτερεί έναντι άλλων που χρησιμοποιούν πρωτεϊνικά αντιγόνα για τον ίδιο σκοπό, διότι επιτρέπει την έκφραση του μορίου του TSH-R στη μεμβράνη αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων στο δέρμα με τον ίδιο τρόπο που εκφράζεται ο φυσιολογικός υποδοχέας σε θυρεοειδικά κύτταρα. Ταυτόχρονα, όπως έχει ήδη αποδειχτεί σε πολλές μελέτες παραγωγής εμβολίων, η μέθοδος ανοσοποίησης με γονίδια επιτρέπει την ενεργοποίηση βοηθητικών και κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων.Η νόσος του Graves (GD) χαρακτηρίζεται από την παθογονική δράση αυτοαντισωμάτων έναντι του υποδοχέα της ορμόνης θυρεοτροπίνης (TSH-R) στην επιφάνεια των θυρεοειδικών κυττάρων. Αυτά τα αντισώματα μιμούνται τη δράση της ορμόνης, οδηγώντας συχνά σε υπερδιέγερση των θυρεοκυττάρων και αυξημένη παραγωγή και έκκριση θυροξίνης στην κυκλοφορία. Μέχρι σήμερα δεν έχει αναπτυχθεί πειραματικό μοντέλο που να αναπαράγει σταθερά τα περισσότερα συμπτώματα της ανθρώπινης νόσου, κυρίως λόγω του ότι ο TSH-R εκφράζεται στα θυρεοειδικά κύτταρα σε χαμηλή συγκέντρωση και δεν είναι εύκολο να απομονωθεί σε μεγάλες ποσότητες, απαραίτητες για μελέτες σε ζώα. Αυτό το πεδίο έρευνας παρουσιάζει διεθνές ενδιαφέρον και είναι ιδιαίτερα ανταγωνιστικό. Η στρατηγική που ακολουθείται είναι η ενδοδερμική ανοσοποίηση ποντικών με το γονίδιο (naked DNA) του υποδοχέα της θυρεοτροπίνης (TSH-R) (χρήση πλασμιδίων που φέρουν το γονίδιο του υποδοχέα της TSH του ανθρώπινου ή που φέρουν μαζί και γονίδια που κωδικοποιούν κυτταροκίνες ή για συνδιεγερτικά μόρια). Η μέθοδος αυτή υπερτερεί έναντι άλλων που χρησιμοποιούν πρωτεϊνικά αντιγόνα για τον ίδιο σκοπό, διότι επιτρέπει την έκφραση του μορίου του TSH-R στη μεμβράνη αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων στο δέρμα με τον ίδιο τρόπο που εκφράζεται ο φυσιολογικός υποδοχέας σε θυρεοειδικά κύτταρα. Ταυτόχρονα, όπως έχει ήδη αποδειχτεί σε πολλές μελέτες παραγωγής εμβολίων, η μέθοδος ανοσοποίησης με γονίδια επιτρέπει την ενεργοποίηση βοηθητικών και κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων.

Τα CD4+CD25+ ρυθμιστικά είναι ζωτικά στη διατήρηση της ανοσολογικής ανοχής. Πρόσφατα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα Tregs είναι δυνατόν να παραχθούν in vitro μέσω καλλιέργειας περιφερειακών CD4+CD25- Τ-κυττάρων παρουσία αντι-CD3 αντισωμάτων και του παράγοντα TGF-β. Ωστόσο δεν είναι ακόμη σαφές αν αυτή η μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί για την παραγωγή Tregs, ορισμένης ειδικότητας, τα οποία να μπορούν είτε να αποτρέψουν την εκδήλωση ενός αυτοάνοσου νοσήματος, είτε να το καταστείλουν. Στόχος μας είναι να ελέγξουμε αυτή την υπόθεση στο μοντέλο της EAT. Η παραπάνω μεθοδολογία θα εφαρμοστεί σε Τ-κύτταρα από διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν έναν TCR ειδικό για το παθογονικό πεπτίδιο p2494 της Tg και θα ελέγξουμε περαιτέρω την ρυθμιστική-κατασταλτική δράση τους τόσο in vitro  όσο και in vivo.

Το Εργαστήριο Ανοσολογίας, με τη συμμετοχή του σε αρκετά προγράμματα εφαρμοσμένης έρευνας (ΝΑΤΟ, ΕΠΕΤ ΙΙ-ΓΓΕΤ, FAIR-EU) σε συνεργασία με το Ανοσολογικό Εργαστήριο του «Αγ. Σάββα» και τον τομέα παραγωγής (φαρμακοβιομηχανίες Φαρμαλέξ και Ελπέν), κατέχει σήμερα την τεχνογνωσία για την ανάπτυξη νέων ανοσολογικών προϊόντων (αντιδραστήρια και ανοσοδοκιμασίες με ευρύ φάσμα εφαρμογών).
Στις ανοσοδοκιμασίες περιλαμβάνονται:

• Ανοσοδιαγνωστικές δοκιμασίες για ιογενείς λοιμώξεις (π.χ. ηπατίτιδα Β, HIV1/2) και  για αυτοάνοσες ασθένειες (π.χ. θυρεοειδούς)  
• Ανοσοδοκιμασίες για τον προσδιορισμό ποικίλων βιομορίων (π.χ. κυτταροκίνες) 
• Ανοσοδοκιμασίες για τον προσδιορισμό βιοχημικών δεικτών ποιότητας του κρέατος που διοχετεύεται στην αγορά

Σήμερα, το Εργαστήριο εστιάζεται στην ανάπτυξη νέων διαγνωστικών ανοσοδοκιμασιών για τις αυτοάνοσες ασθένειες του θυρεοειδούς και ανοσοδοκιμασιών για την εκτίμηση της ποιότητας του κρέατος.

Στα αντιδραστήρια περιλαμβάνονται:

• Η ανθρώπινη θυρεοσφαιρίνη η οποία απομονώνεται από ανθρώπινο ιστό (Διατίθεται ήδη στο εμπόριο, με υψηλό βαθμό καθαρότητας  για ερευνητικούς σκοπούς)
• Μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της ανθρώπινης θυρεοσφαιρίνης με διαφορετική εξειδίκευση (π.χ. αναγνώριση των ορμονών Τ3 και Τ4, ή μόνο της Τ4).

Ένας από τους κύριους στόχους της βιοϊατρικής είναι η αποτελεσματική και άμεση μεταφορά βιομορίων μέσα στα κύτταρα για τη θεραπεία ποικίλων ασθενειών. Τα τελευταία 15 χρόνια, έχει δειχθεί ότι πολλές πρωτεΐνες (tat, antanapedia, αντισώματα, κ.λ.π.) μπορούν να διεισδύουν σε ζωντανά κύτταρα και ιστούς. Η διεισδυτική αυτή ικανότητα αποδόθηκε σε πεπτίδια 10-20 αμινοξικών καταλοίπων. Η περαιτέρω χρήση τους ς φορείς για την ενδοκυττάρια μεταφορά μορίων έδωσε ενθαρρυντικά in vitro αποτελέσματα αλλά όχι in vivo. Ολόκληρες πρωτεΐνες δεν έχουν ακόμα εξεταστεί ως προς την ικανότητά τους να μεταφέρουν βιομόρια λόγω της τοξικότητάς τους ή/και της ανοσογονικότητάς τους. Εξαίρεση του προηγουμένου αποτελούν τα διεισδυτικά μονοκλωνικά αντι-DNA αντισώματα προερχόμενα από ποντίκια με λύκο, τα οποία έδωσαν θετικά αποτελέσματα στις in vitro μελέτες (in vivo μελέτες δεν έχουν αναφερθεί μέχρι σήμερα). Εν συντομία, θα δημιουργήσουμε μια βιβλιοθήκη μονοκλωνικών αντισωμάτων (προερχόμενα από μη ανοσοποιημένα ποντίκια με «αυθόρμητα εκδηλούμενο» λύκο ή ποντίκια BALB/c με μαλάρια), θα επιλέξουμε εκείνα τα οποία έχουν διεισδυτική ικανότητα και θα διερευνήσουμε in vitro την ιδιότητά τους να μεταφέρουν ουσίες σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές διαφορετικής προέλευσης (ινοβλάστες, ηπατοκύτταρα, νευρογλοιακά και επιθηλιακά κύτταρα). Στη συνέχεια, τα αντισώματα θα συζευχθούν με φθορίζοντα απτένια (φλουορεσκείνη, ροδαμίνη) ή μακρομόρια (φυκοερυθρίνη) και θα εξεταστεί η in vitro ικανότητά τους να μεταφέρουν τις παραπάνω ουσίες μέσα στα κύτταρα. Ένα επόμενο βήμα θα είναι η ανοσοποίηση ποντικών με τα σημασμένα διεισδυτικά αντισώματα και η διερεύνηση της κατανομή τους στους ιστούς, που θα  αξιολογηθεί με μικροσκόπιο φθορισμού. Τα αντισώματα με in vivo δράση θα «ανθρωποποιηθούν» και θα μελετηθούν περαιτέρω. Έτσι, τα διεισδυτικά αντισώματα μπορεί να αποτελούν έναν ιδανικό φορέα για την ενδοκυτταρική μεταφορά βιομορίων με απώτερο στόχο τη χρησιμοποίησή τους ως αντισώματα-φορείς στους ανθρώπους. Αυτά τα πρωτοποριακά προϊόντα μπορούν να βρουν εφαρμογή σε πολλούς τομείς και ειδικότερα στην περίπτωση των μολυσματικών ασθενειών στις οποίες εμπλέκονται ενδοκυττάριοι παθογόνοι παράγοντες, και οι οποίες είναι πρώτης προτεραιότητας όχι μόνο για το δίκτυο των Ινστιτούτων Παστέρ, αλλά και για την Π.Ο.Υ.

• Εργαστηριακές ασκήσεις - Εκπαίδευση προπτυχιακών και μεταπτυχιακών φοιτητών
• Επίβλεψη Διδακτορικών Διατριβών σε συνεργασία με τα Ελληνικά Πανεπιστήμια
• Οργάνωση και συμμετοχή στον Εκπαιδευτικό Κύκλο του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ (περιλαμβάνει: Μετεκπαιδευτικό Σεμινάριο με θέμα τη Σύγχρονη Διαγνωστική Μεθοδολογία σε λοιμώδη και αυτοάνοσα νοσήματα καθώς και Σειρά διαλέξεων σε ποικίλα επίκαιρα θέματα, τα οποία παρουσιάζουν επιστήμονες από όλη τη χώρα, καθ’όλη τη διάρκεια του έτους)
• Οργάνωση και συμμετοχή στις Εκπαιδευτικές Δραστηριότητες άλλων Φορέων (Παν/μια / προγράμματα μεταπτυχιακών σπουδών, Υπουργείο Υγείας-Πρόνοιας, Επιστημονικές Εταιρίες)
• Συγγραφή Σημειώσεων και Εργαστηριακών Μεθόδων στα πλαίσια Σεμιναρίων και συγγραφή κεφαλαίων ή μετάφραση εκπαιδευτικών βιβλίων