Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ » ‘Ερευνα » Τμήμα Μικροβιολογίας » Ομάδα Ενδοκυττάριου Παρασιτισμού

Ομάδα Ενδοκυττάριου Παρασιτισμού

ΥπεύθυνοςΟμάδας: Δρ. Χαραλαμπία Μπολέτη

Τηλ: 210-6478879, Email: hboleti@pasteur.gr

Αρχική

H Oμάδα Ενδοκυττάριου Παρασιτισμού μελετά θέματα της Μοριακής Κυτταρικής Βιολογίας του παρασίτου Leishmania donovani, αιτιολογικού παράγοντα της σπλαχνικής Λεϊσμανίασης (kala azar), και της αλληλεπίδρασης του παρασίτου με τα μακροφάγα κύτταρα του θηλαστικού ξενιστή. Τα κύρια ερευνητικά ενδιαφέροντα της ομάδας εστιάζονται σε

1) μοριακούς μηχανισμούς φαγοκύττωσης του παρασίτου Leishmania donovani, σε επαγγελματίες φαγοκύτταρα και το ρόλο υποθετικών μολυσματικών  παραγόντων στην ωρίμανση και την αναδιαμόρφωση του Λεϊσμανιόφορου φαγοσώματος.

2) δομικό και λειτουργικό χαρακτηρισμό ειδικών φωσφατασών του παρασίτου Leishmania donovani.

3) αξιοποίηση του μη παθογόνου οργανισμού Leishmania tarentolae σαν εναλλακτικό σύστημα ετερόλογης έκφρασης ευκαρυωτικών πρωτεϊνών με δυσκολία έκφρασης σε βακτήρια.

Στόχος μας είναι να συμβάλουμε στην κατανόηση των αρχικών σταδίων της μόλυνσης, μετά το τσίμπημα της σκνίπας,  καθώς και στην ταυτοποίηση και μελέτη νέων εν δυνάμει μοριακών στόχων για ανάπτυξη φαρμάκων.

Η Λεϊσμανίαση είναι ομάδα ασθενειών υψίστης σημασίας για την Δημόσια Υγεία. Πάνω από 350 εκατομμύρια άνθρωποι σε 88 χώρες απειλούνται παγκόσμια να προσβληθούν με τις διάφορες μορφές της νόσου και 12 εκατομμύρια άνθρωποι είναι μολυσμένοι με 2 εκατομμύρια νέες μολύνσεις το έτος (ΠΟΥ). Στην Ευρωπαϊκή ήπειρο, τα παράσιτα των ειδών Leishmania, αιτιολογικοί παράγοντες των  Λεϊσμανιάσεων, ενώ πιστευόταν ότι είναι υπό έλεγχο, επανεμφανίστηκαν σε ορισμένες χώρες της νότιας Μεσογείου συμπεριλαμβανομένων των Βαλκανίων και της Ελλάδας. Τα συμπτώματα της Λεϊσμανίασης κυμαίνονται από δερματικές παραμορφώσεις και βλεννογονοδερματικές βλάβες που μπορεί να προκαλέσουν εκτεταμένη καταστροφή των βλεννογόνων, σε σπλαχνική ασθένεια (VL, kala-azar), που επηρεάζει τα αιμοποιητικά όργανα, και που αν αφεθεί χωρίς θεραπεία είναι θανατηφόρα.

Δεν υπάρχουν προστατευτικά εμβόλια για τον άνθρωπο οι τρέχουσες θεραπείες με φάρμακα είναι αναποτελεσματικές λόγω της αύξησης ανθεκτικών στελεχών, της υψηλής τοξικότητας και τών υψηλών τιμών των φαρμάκων. Για τους λόγους αυτούς, ο ΠΟΥ θεωρεί επιτακτική ανάγκη την ανάπτυξη νέων μη τοξικών φαρμάκων και εμβολίων για τον έλεγχο του αυξανόμενου αριθμού των περιπτώσεων Λεϊσμανίασης.

Ερευνητικά προγράμματα

1) Μελέτη των μηχανισμών φαγοκύτωσης και επιβίωσης του παρασίτου Leishmania στα φαγοκύτταρα του θηλαστικού ξενιστή (Α.Παπαδάκη & Χ.Μπολέτη)

Τα παράσιτα Leishmania, μέλη της οικογένειας των πρωτοζώων Trypanosomatidae με περισσότερα από 20 περιγεγραμμένα είδη μέχρι τώρα, μεταδίδονται στον θηλαστικό ξενιστή με το γεύμα αίματος του εντόμου φορέα (σκνίπα του γένους Phlebotomus ή Lutzomyia). Το πρώτο βήμα της αλληλεπίδρασης του παρασίτου Leishmania μετά το τσίμπιμα της σκνίπας είναι η είσοδος στα φαγοκύτταρα  (μακροφάγα, ουδετερόφιλα, δενδριτικά) του ανοσοποιητικού συστήματος με φαγοκύτωση. Μετά την είσοδό τους στα μακροφάγα, οι προμαστιγωτές μορφές των παρασίτων Leishmania, προκαλούν καθυστέρηση στη βιογένεση του παρασιτόφορου φαγοσώματος σε φαγολυσόσωμα, προκειμένου να εδραιωθεί η μόλυνση σε ένα μη οξειδωτικό περιβάλλον. Από τη στιγμή που διαφοροποιούνται σε αμαστιγωτά η ωρίμανση του παρασιτόφορου φαγοσώματος προχωρά στο στάδιο του φαγολυσοσώματος. Η επιβίωση του παρασίτου στα φαγοκύτταρα οφείλεται σε παρεμβολές  και ανατροπή της λειτουργίας σηματοδοτικών μονοπατιών που σχετίζονται με πολλές πτυχές της φυσιολογίας των κυττάρων ξενιστών, συμπεριλαμβανομένων εκείνων της ωρίμανσης του φαγοσώματος και της απόπτωσης.

  1. Διερευνούμε τηv υπόθεση το παράσιτο  L.donovani να ανατρέπει άμεσα ή έμμεσα τη χωροχρονική κατανομή και τη σηματοδοτική δράση συγκεκριμένων ειδών φωσφοϊνοσιτιδίων στα μακροφάγα του ξενιστή κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης του παρασιτόφορου φαγοσώματος.
  2. Mελετούμε υποθετικούς παράγοντες μολυσματικότητας του παρασίτου, επιφανειακά ή εκκρινόμενα μόρια, που ενδεχομένως εμπλέκονται στην ωρίμανση και  αναδιαμόρφωση του Λεϊσμανιόφορου φαγοσώματος και την επιβίωση και πολλαπλασιασμό του παρασίτου σε αυτό.
Στις μελέτες αυτές, ακολουθούμε τα βήματα φαγοκύτωσης παρασίτων L.donovani σε μακροφάγα με σύγχρονες τεχνικές μικροσκοπίας και  time-lapse μικροσκοπία φθορισμού και χρησιμοποιούμε γενετικά τροποποιημένα παράσιτα L. donovani 

που εκφράζουν GFP ή RFP φθορίζουσες πρωτεΐνες και κυτταρικές σειρές μακροφάγων (J774, Raw264.7, THP1) που εκφράζουν υβριδικά GFP πολυπεπτίδια με δράση πρόσδεσης σε φωσφοϊνοσιτίδια. Πιθανοί παράγοντες παθογένειας έχουν κλωνοποιηθεί και εκφράζονται σε ετερόλογα κυτταρικά συστήματα για δομικές και λειτουργικές μελέτες. Επιπλέον, έχουμε δημιουργήσει διαγονιδιακά στελέχη Leishmania donovani που υπερεκφράζουν τους πιθανούς μολυσματικούς παράγοντες και αξιολογούμε την ικανότητά τους να μολύνουν και να επιβιώνουν σε μακροφάγα κύτταρα με τεχνικές FACS και μικροσκοπίας φθορισμού.

 

2) Χαρακτηρισμός των δομικών και λειτουργικών ιδιοτήτων ειδικών L. donovani φωσφατασών (Α.Παπαδάκη, Α.Κοτοπούλη, Χ.Μπολέτη)

Επίκεντρο των εργασιών μας τα τελευταία 3 χρόνια είναι η μελέτη της οριζόμενης ως LdMacP (LdAcP3.1_AF149839.1) όξινης εκτο φωσφατάσης ιστιδίνης από το L.dovovani και δύο μέλη από την ομάδα των άτυπων φωσφατασών  λιπιδίων διπλής ειδικότητας (aDSPs lipid like, Beresford, N.J. et al. 2010) οριζόμενες ως LdPIP22 ( LDBPK_220120) και LdPIP33 (LDBPK_332990).

Η LdMacP  εκτο φωσφατάση εντοπίστηκε αρχικά με μοριακή κλωνοποίηση (Shakarian, A.M., et al.2002), ως μια πρωτεΐνη ομόλογη της εκκρινόμενης (LdSAcP1) όξινης φωσφατάσης ιστιδίνης (Shakarian, A.M., et al.1997) από το L. Donovani. Η LdMacP είναι εάν μεμβρανικό ένζυμο με την καταλυτική περιοχή προσανατολισμένη στην εξωκυτάρια επιφάνεια του παρασίτου και έχει προταθεί ότι προσδίδει την  ανθεκτική σε τρυγικό δράση όξινης εκτο φωσφατάσης που εμπλέκεται στην μολυσματικότητα των προμαστιγωτών. Οι μελέτες μας στοχεύουν στην ολοκλήρωση του χαρακτηρισμού των δομικών και λειτουργικών ιδιοτήτων της πρωτείνης καθώς και του πιθανού ρόλου της στην μολυσματικόητα του παρασίτου.

Οι μελέτες μας με τις LdPIPh22 και LdPIPh33 υποθετικές φωσφατάσες φωσφοϊνοσιτιδίων  έχουν σαν στόχο την αξιολόγησή τους ως εν δυνάμει μοριακούς στόχους για ανάπτυξη φαρμάκων. Τα ένζυμα αυτά ανήκουν στην οικογένεια των άτυπων φωσφατασών λιπιδίων to που έχει περιγραφεί σε βακτήρια και κατώτερα ευκαρυωτικά  (Beresford, N.J. et al. 2010) και είναι ομόλογες στην Mptb φωσφατάση του Mycobacterium tuberculosis που είναι κύριος μολυσματικός παράγοντας του παρασίτου. Ανασυνδιασμένη rLdPIPh22-8His πρωτεΐνη εκφρασμένη σε βακτήρια, παρουσιάζει δράση φωσφατάσης in vitro, σε δοκιμασία με συνθετικό υπόστρωμα p-nitrophenyl-phosphate [pNPP]. Η εξειδίκευση υποστρώματος είναι υπό μελέτη. Βιοχημικές και κυτταρικές τεχνικές χρησιμοποιούνται για τη μελέτη των λειτουργικών και δομικών ιδιοτήτων των δύο πρωτεϊνών.

3) Αξιολόγηση του οργανισμού Leishmania tarentolae LEXSY ως εναλλακτικό σύστημα έκφρασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών από ανώτερα ευκαρυωτικά (Α.Δούκας, Χ.Μπολέτη)

 Στο πλαίσιο συνεργασίας με το πρόγραμμα Θαλής-EVOTRNANS χρησιμοποιούμε το L. tarentolae pLexsy σύστημα έκφρασης ευκαρυωτικών πρωτεϊνών (Breitling R,et al & Alexandrov K. 2002. Βasile G, Peticca M. 2009) για να εκφράσουμε μεταφορείς νουκλεοβάσεων από θηλαστικούς οργανισμούς. Ο οργανισμός L. tarentolae χρησιμοποιείται σε περιβάλλον βιοασφάλειας S1, ως μη παθογόνος στον άνθρωπο, απαιτεί απλά θρεπτικά συστατικά για την ανάπτυξη του  σε καλλιέργεια, επιτρέπει αποτελεσματική N-γλυκοσυλίωση στις πρωτεΐνες θηλαστικών (χρησιμοποιώντας παρόμοιο μοτίβο δικεραιωτής γλυκάνης, που δεν υπάρχει σε ζυμομύκητες ή Drosophila) και παρουσιάζει φυσική αυξοτροφία σε διάφορα αμινοξέα γεγονός που διευκολύνει σήμανση πρωτεϊνών με ισότοπα για δομικές μελέτες (π.χ ΝΜR). Επίσης, χρησιμοποιούμε το σύστημα αυτό για να παράγουμε και να καθαρίσουμε από το εξωκυττάριο μέσο καλλιέργειας L. tarentolae ενεργά  L. donovani ένζυμα για τις μελέτες μας.

Mέλη

Υπεύθυνη Oμάδας:

Χαραλαμπία Μπολέτη, MSc, PhD, Ερευνήτρια Β’,  hboleti@pasteur.gr

Υποψήφιοι Διδάκτορες:

Αμαλία Παπαδάκη, Kτηνίατρος, ΜSc,  apapadaki@pasteur.gr

Μεταπτυχιακοί φοιτητές:

Ανάργυρος Δούκας, Xημικός , andoukas@pasteur.gr

Φοιτητές πρακτικής άσκησης:

Ολύβια Τζιουβάρα, Βιολόγος επί πτυχείω, oltziouvara@pasteur.gr

Πρώην Μέλη

Αναστασία Κοτοπούλη, Χημικός, ΜSc Bιοχημεία

Μαρία Π. Κοτίνη, Βιολόγος, Πτυχιακή άσκηση

Χρηματοδοτήσεις

2010-2015

  • IKYDA 2014 -ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΠΡΟΩΘΗΣΗΣ ΤΩΝ ΑΝΤΑΛΛΑΓΩΝ ΚΑΙ ΤΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΗΣ ΣΥΝΕΡΓΑΣΙΑΣ ΕΛΛΑΔΑΣ – ΓΕΡΜΑΝΙΑΣ. Tίτλος έργου: LeishPhospho: Μοριακός χαρακτηρισμός συγκεκριμένων φωσφατασών των ενδοκυττάριων παρασιτικών πρωτοζώων Leishmania donovani και διερεύνηση της δυνατότητας ανάδειξής τους σε φαρμακευτικούς στόχους. (2014-2015). (Eπιστημ. Υπεύθ. Χ. Μπολέτη): 10,000 €
  • PLATON-ΔΙΜΕΡΗΣ Ε & Τ ΣΥΝΕΡΓΑΣΙΑ ΕΛΛΑΔΑΣ –ΓΑΛΛΙΑΣ 2013 Τίτλος έργου: LeishPhosphoTox: Μοριακός και λειτουργικός χαρακτηρισμός συγκεκριμένων φωσφατασών των ενδοκυττάριων παρασιτικών πρωτοζώων Leishmania donovani και Toxoplasma gondii που προκαλούν ανθρωποζωονόσους. Μελέτη του ρόλου τους στην αλληλεπίδραση των παρασίτων με τα κύτταρα ξενιστές και διερεύνηση του δυναμικού τους ως φαρμακευτικών στόχων (2013-2015). (Eπιστημ. Υπεύθ. Χ. Μπολέτη): 30,000 €
  • ΚΡΗΠΙΣ: Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας  Τίτλος έργου: Μολυσματικές και Νευροεκφυλιστικές νόσοι στον 21o αιώνα . Από τη μελέτη των βασικών μηχανισμών στην ανάπτυξη μεταφραστικής έρευνας και τεχνολογιών αιχμής με στόχο τη διάγνωση την πρόληψη και τη θεραπεία. Υποέργο EE2.5: Μηχισμοί επιβίωσης των παρασίτων L.donovani στο μακροφάγο κύτταρο ξενιστή και ταυτοποίηση μολυσματικών παραγόντων.  Υποέργο EE 4.5:  Ταυτοποίηση, αξιολόγηση και χαρακτηρισμός εν δυνάμει μοριακών στόχων για ανάπτυξη αντι-λεισμανιακών φαρμάκων. (2013-2015). (Συντονιστής φορέας: Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ). Χρηματοδότηση ‘Μονάδα Ενδοκυττάριου παρασιτισμού’: 42,900 €
  • ΘΑΛΗΣ: Τίτλος έργου: EVOTRANS-Μεμβρανική Μεταφορά: Σχέσεις Δομής-Λειτουργίας και Εξέλιξης.  (2012-2015). (Συντονιστής έργου: E.Φριλίγγος. Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων. Επιστημ. Υπευθ.  Π.Ε.1-4 στο  ΕΙΠ: Χ.Μπολέτη): 40,000 €
  • ΧΟΡΗΓΕΙΑ Genesis Pharma: Τίτλος έργου: Mελέτη μοριακών μηχανισμών με τους οποίους το πρωτοζωϊκό παράσιτο Leishmania donovani μολύνει ανθρώπους και κατοικίδια ζώα και προκαλεί την ασθένεια Kalaazar. (Ερευνητική Ομάδα Ενδοκυττάριου Παρασιτισμού. Επιστημ. Υπεύθ.: Χ. Μπολέτη)   (19 Απριλίου 2011):  15.000 €

Δημοσιεύσεις

2003-2013

Athanasopoulos A, Boleti H, Scazzocchio C, Sophianopoulou V. (2013). Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genet Biol. 53:84-96.

Kalliampakou KI, Kouri ED, Boleti H, Pavli O, Maurousset L, Udvardi MK, Katinakis P, Lemoine R, Flemetakis E.(2011). Cloning and functional characterization of LjPLT4, a plasma membrane xylitol H(+)- symporter from Lotus japonicus. Mol Membr Biol. 28(1):1-13

Boleti H, Smirlis D, Dalagiorgou G, Meurs EF, Christoforidis S, Mavromara P. (2010). ER targeting and retention of the HCV NS4B protein relies on the concerted action of multiple structural features including its transmembrane domains. Mol Membr Biol. 27(1):50-74

Smirlis D, Boleti H, Gaitanou M, Soto M, Soteriadou K. (2009). Leishmania donovani Ran-GTPase interacts at the nuclear rim with linker histone H1. Biochem J. 424(3):367-74.

Karanasios E, Boleti H, Simos G. (2008).Incorporation of the Arc1p tRNA-binding domain to the catalytic core of MetRS can functionally replace the yeast Arc1p-MetRS complex. J Mol Biol. 381(3):763-71.

Vassilaki N, Boleti H, Mavromara P. (2008). Expression studies of the HCV-1a core+1 open reading frame in mammalian cells.Virus Res. 133(2):123-35.

Vassilaki N, Boleti H, Mavromara P. (2007). Expression studies of the core+1 protein of the hepatitis C virus 1a in mammalian cells. The influence of the core protein and proteasomes on the intracellular levels of core+1. FEBS J. 274(16): 4057-74

Ibrahim-Granet O, Philippe B, Boleti H, Boisvieux-Ulrich E, Grenet D, Stern M, Latgé JP. (2003). Phagocytosis and intracellular fate of Aspergillus fumigatus conidia in alveolar macrophages. Infect Immun. 71(2):891-903