Μονάδα Κυτταρομετρίας Ροής

Υπεύθυνη Ερευνήτρια:  Δέσποινα Σμυρλή, PhD, Εργαστήριο Μορ. Παρασιτολογίας, Τμήμα Μικροβιολογίας
Email: penny@pasteur.gr  Τηλ: +30 210 6478841

Ειδικός Τεχνικός Επιστήμονας (ΕΤΕ): Ευαγγελία Ξύγγη, PhD
Email: exingi@pasteur.gr Τηλ: +30 210 6478834

Επισκόπηση

Επισκόπηση

Το ΕΙΠ διαθέτει εξοπλισμό Κυτταρομετρίας Ροής με κυτταρομετρητή ροής διαλογής κυττάρων FACS ARIA και κυτταρομετρητή ροής FACS Calibur. Οι εγκαταστάσεις υποστηρίζονται από  την ερευνήτρια Δέσποινα Σμυρλή (επιστημονικός υπεύθυνος) που ειδικεύεται στον τομέα της Μοριακής Μικροβιολογίας και την τεχνικό Ευαγγελία Ξύγγη.
Στόχος των υποδομών  είναι να παρέχονται σύγχρονες τεχνικές κυτταρομετρίας ροής και διαχωρισμού κυτταρικών πληθυσμών στους επιστήμονες του ΕΙΠ καθώς και σε εξωτερικούς χρήστες.
Η κυτταρομετρία ροής αποτελεί μία αυτοματοποιημένη ποσοτική, δυναμική και πολυπαραμετρική μέθοδο ανάλυσης των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών κυττάρων και σωματιδίων, με βάση τη σκέδαση του φωτός και την εκπομπή φθορισμού από τα σωματίδια. Ο κυτταρομετρητής ροής μπορεί να χαρακτηριστεί ως ένας επιτυχής συνδυασμός αιματολογικού αναλυτή και φθορίζοντος μικροσκοπίου, που εφαρμόζει τα τελευταία επιτεύγματα στον τομέα της μικροσκοπίας, της βιοχημικής ανάλυσης και της εξέλιξης των ηλεκτρονικών υπολογιστών.

Υδροδυναμική εστίαση του δείγματος μέσα από το θάλαμο ροής

Απλοποιημένη σχηματική αναπαράσταση της κυτταρομετρίας ροής

Υποδομή

1. FACS Aria Κυτταρομετρητής ροής διαλογής κυττάρων

Το FACS Aria είναι ένας κυτταρομετρητής ροής διαλογής κυττάρων υψηλής ταχύτητας και ψηφιακής λήψης 70.000 δεδομένων ανά δευτερόλεπτο. To FACS Aria του ΕΙΠ είναι εξοπλισμένο με ένα laser Argon (μπλε-488 nm) και ένα laser He/Ne (κόκκινο-633 nm).

Το σύστημα είναι επίσης εξοπλισμένο με ένα οκτάγωνο με έξι φωτοπολλαπλασιαστές– PMTs, οι οποίοι ανιχνεύουν τον φθορισμό που προέρχεται από το laser Argon (488 nm) και ένα τρίγωνο με δύο φωτοπολλαπλασιαστές–PMTs, οι οποίοι ανιχνεύουν τον φθορισμό που προέρχεται από το laser ανιχνεύσει μέχρι και 7 διαφορετικά φθοριοχρώματα και δύο παραμέτρους σκέδασης ταυτόχρονα. Τα δείγματα που προκύπτουν μετά τον διαχωρισμό των κυτταρικών πληθυσμών συλλέγονται σε έως και τέσσερις πλαστικούς σωλήνες κυτταρομετρίας των 5 ml. Το λογισμικό BD FACS Diva software 6 με το οποίο λειτουργεί το FACS Aria χρησιμοποιείται για συλλογή και για ανάλυση δεδομένων.

Η ανάλυση δεδομένων του FACS Aria μπορεί να γίνει και από ένα δεύτερο υπολογιστή εγκατεστημένο στη μονάδα που διαθέτει το  λογισμικό BD FACS Diva software 6.

2. Κυτταρομετρητής ροής FACSCalibur

Ο κυτταρομετρητής ροής FACSCalibur είναι εξοπλισμένος με ένα Argon laser 488 nm και ένα κόκκινο laser 635 nm. Ο κυτταρομετρητής ροής είναι συνδεδεμένος με τον υπολογιστή BD FACStation™ v6.0x MacOS® X, ο οποίος χρησιμοποιεί το λογισμικό BD CellQuest™ Pro για συλλογή των αποτελεσμάτων και ανάλυση τους. Το σύστημα είναι επίσης εξοπλισμένο με το λογισμικό ModFitLT για ανάλυση του κυτταρικού κύκλου.

Πίνακας με τα χαρακτηριστικά των κυτταρομετρητών ροής

Κανονισμοί

Κανονισμοί

Για τους χρήστες του ΕΙΠ:

 

FACS Aria Κυτταρομετρητής ροής διαλογής κυττάρων: ο χειρισμός του μηχανήματος γίνεται μόνο από την υπεύθυνη τεχνικό. Όλοι οι χρήστες που ενδιαφέρονται να χρησιμοποιήσουν το μηχάνημα θα πρέπει να επικοινωνήσουν μαζί της.

FACS Calibur Κυτταρομετρητής ροής: οι χρήστες πρέπει να κάνουν κράτηση μέσω του αρχείου που συμπληρώνουν ηλεκτρονικά (online booking file).

Για τους επιστήμονες του ΕΙΠ η χρήση των κυτταρομετρητών ροής γίνεται χωρίς χρέωση.

Για εξωτερικούς χρήστες:

 

Οι κυτταρομετρητές ροής μπορούν να χρησιμοποιηθούν από εξωτερικούς χρήστες, μετά από επικοινωνία με τις υπευθύνους επιστήμονες για κράτηση των μηχανημάτων.  Υπάρχει μία συμβολική χρέωση 20 € / ώρα χρήσης.

Παρασκευή δειγμάτων

Παρασκευή δειγμάτων για την κυτταρομετρία ροής

«Στήσιμο» του πειράματος:

Σε περίπτωση που οι χρήστες έχουν απορίες σχετικά με τα φθοριοχρώματα που θα πρέπει να χρησιμοποιήσουν στο πείραμα τους ή το «στήσιμο» του πειράματος τους, θα πρέπει να έρθουν σε επαφή με τους υπεύθυνους επιστήμονες, ώστε να συζητήσουν το πείραμα τους. Οι χρήστες θα πρέπει να έχουν τους απαραίτητους μάρτυρες για τα πειράματα τους, συγκεκριμένα:

  1. ένα μη σημασμένο μάρτυρα με τον ίδιο τύπο κυττάρων όπως και τα δείγματα: χωρίς φθοριοχρώματα, αντισώματα, δεύτερα αντισώματα.
  2. μονά σημασμένοι μάρτυρες με τα ίδια φθοριοχρώματα, όπως και αυτά που χρησιμοποιούνται στο πείραμα.

Είναι επίσης πολύ σημαντικό να γνωρίζουμε ότι αποφεύγεται η χρήση του ιωδιούχου προπιδίου (PI)  για το FACS Aria, ενώ συνίσταται η χρήση της χρωστικής 7-AAD.

 

Προετοιμασία των δειγμάτων:

Τα δείγματα πρέπει να βρίσκονται σε single cell suspension in PBS. Η ιδανική συγκέντρωση εξαρτάται από τον τύπο των κυττάρων που μελετάμε (106-107 κύτταρα/ml). Σε όλες τις περιπτώσεις τα δείγματα πρέπει να τοποθετούνται σε πλαστικούς σωλήνες κυτταρομετρίας των 5mL (12x75mm, BD ordering code: 352052) ή στους ίδιους σωλήνες με καπάκι (BD ordering code: 352054). Τα συσσωματώματα μέσα στα δείγματα πρέπει να αποφεύγονται.

Συλλογή δειγμάτων για το FACSAria:

Το FACSAria μπορεί να διαχωρίσει μέχρι και τέσσερις πληθυσμούς ταυτόχρονα. Οι σωλήνες συλλογής είναι οι πλαστικοί σωλήνες κυτταρομετρίας των 5mL με καπάκι (BD ordering code: 352054). Στους σωλήνες συνίσταται να υπάρχει περίπου 2-3 mL υλικό κυτταροκαλλιέργειας με BSA ή FCS. Επίσης προτείνεται η προσθήκη αντιβιοτικών για να αποφευχθεί μόλυνση των δειγμάτων.

Εκπαίδευση

Εκπαίδευση χρηστών στον κυτταρομετρητή ροής FACS Calibur

Κάθε νέος χρήστης του κυτταρομετρητή ροής FACS Calibur πρέπει να πραγματοποιήσει μια διαδικασία εκπαίδευσης από την υπεύθυνη τεχνικό. Συγκεκριμένα ο νέος χρήστης πρέπει:

  • Καταρχήν να εκπαιδευτεί στις βασικές αρχές χρήσης του μηχανήματος, καθώς και τις δυνατότητες που υπάρχουν για συγκεκριμένες εφαρμογές που τον ενδιαφέρουν.
  • Κατά τις τρεις πρώτες φορές που θα χρησιμοποιήσει το μηχάνημα και μέχρι να εξοικειωθεί με  τη χρήση του, να εκπαιδευτεί από την υπεύθυνη τεχνικό.
Σύνδεσμοι

Σύνδεσμοι

1. Πληροφορίες σχετικά με τους κυτταρομετρητές ροής του ΕΙΠ

 

 

2. Γενικές πληροφορίες για την κυτταρομετρία ροής

3. Φθοριοχρώματα και Compensation

  • Guide to compensation (http://drmr.com/compensation/index.html)
  • Table of Fluorochromes (http://flowcyt.salk.edu/fluo.html)
  • BD Fluorescence Spectrum Viewer, which provides spectral visualization of excitation and emission peaks for many common fluorochromes. (http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/tools/index.jsp)

4. Πρωτόκολλα

BD Pharmingen Protocols (http://www.bdbiosciences.com/support/resources/index.jsp)