Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

Εργαστηριακές μέθοδοι και προετοιμασία βιβλιοθηκών για αλληλούχιση επόμενης γενεάς (NGS library preparations)
• Total DNA and RNA extraction and purification for NGS applications
• Ribodepletion / poly-A enrichment / globin removal / DNase treatment
• Whole Genome Sequencing (WGS) library preparation for viruses, bacteria, fungi, parasites, animals
• Whole Exome Sequencing (WES) library preparation, both target-enrichment- and amplicon-based (human)
• Custom Target Enrichment by hybridisation for regions of interest, from any WGS library preparation
• Targeted gene panels (Comprehensive Cancer, Pharmacogenomics, Inherited disease etc) library preparation
• Whole transcriptome, 3’quantseq and single cell RNAseq library preparation
• Whole genome bisulfite sequencing (WGBS) library preparation
• Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC-seq) and single cell ATAC-seq library preparation
• Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) library preparation

Διαθέσιμες τεχνολογίες αλληλούχισης
• 1st generation – Sanger sequencing on a compact SeqStudio genetic analyser
• 2nd generation – NGS on Ion Torrent (Thermo) and Illumina Platforms with single-end or paired-end short read sequencing
• 3rd generation – NGS on MinION (Oxford Nanopore Technologies) with single-end 1-D or 2-D ultra-long reads both on standard and low throughput flowcells

Βιοπληροφορικές ροές σε εφαρμογή
Η ομάδα της BiGen ανανεώνει και επικαιροποιεί συνεχώς τα βιοπληροφορικά εργαλεία και τις εφαρμογές που χρησιμοποιεί. Κάθε αναλυτικό βήμα ελέγχεται με την βοήθεια εσωτερικών μαρτύρων για την διασφάλιση της ποιότητας των αποτελεσμάτων
Βασικές βιοπληροφορικές ροές:
• Full genome reconstruction, denovo assembly and functional annotation (WGS)
• Whole Genome Single Nucleotides Polymorphisms (SNPs) calling and functional annotation
• Whole Genome large-scale structural variations calling and functional annotation
• Genome Wide Association Studies (GWAS)
• Differential gene expression analysis, Gene Ontologies enrichment analysis and clustering (RNAseq)
• Metagenomics and Metaviromics, microbiome enrichment analysis
• Genome-wide DNA methylation patterns recognition and profiles comparison
• ATAC-seq peak calling, peak differential analysis and annotation, motif enrichment, footprinting, and nucleosome position analysis
• Genome wide double stranded DNA Breaks Labeling In Situ and Sequencing (BLISS)
• Epidemiology: Phylogenetics, phylogenomics, phylodynamics, phylogeography

ΥΠΟΔΟΜΗ

Η BiGen είναι εξοπλισμένη με αναλυτές τελευταίας τεχνολογίας με συμπληρωματικά χαρακτηριστικά, ώστε να προσφέρουν μέγιστη ευελιξία στο σχεδιασμό πειραμάτων οποιασδήποτε τεχνολογίας και οποιασδήποτε κλίμακας.

Ο αναλυτής Illumina NextSeq 2000 χρησιμοποιεί τεχνολογία ενσωματωμένων αντιδραστηρίων σε κασέτα, απλοποιώντας σημαντικά την πειραματική διαδικασία. Υποστηρίζει μεσαίας-μεγάλης κλίμακας εφαρμογές NGS, έχοντας την δυνατότητα να παράγει από 100 εκατ. έως 2.4 δις αναγνώσεις (reads) (30-360Gb), ενώ προσφέρει μεγάλη ευελιξία στον συνδυασμό πολλαπλών δειγμάτων και στην συμβατότητα με αντιδραστήρια πολλών εταιριών. Είναι ιδανικός για μεθόδους όπως exome sequencing, target enrichment, single-cell profiling, transcriptome sequencing, epigenomics κλπ.

Ο αναλυτής Ion S5 NGS system (ThermoFisher Scientific) εκμεταλλεύεται την τεχνολογία των ημιαγωγών για την παραγωγή δεδομένων υψηλής ποιότητας σε λιγότερο από 2.5 ώρες. Ο Ion S5 συνοδεύεται από το σύστημα Ion OneTouch 2 που πραγματοποιεί την προετοιμασία του δείγματος και τον εμπλουτισμό. Κάνει χρήση αντιδραστηρίων σε κασέτα και προσφέρει μεγάλη ευελιξία σε εφαρμογές μεσαίας κλίμακας (0.6 – 30Gb) όπως targeted gene panel sequencing, pathogens WGS κλπ.

Ο αναλυτής MinION NGS (Oxford Nanopore Technologies) είναι μία πλατφόρμα μικρής κλίμακας αν και είναι πλέον σε θέση να παράγει μέχρι 30 Gb δεδομένων DNA (7-12 εκατ. αναγνώσεις). Χαρακτηριστικό της πλατφόρμας είναι οι αναγνώσεις εξαιρετικά μεγάλου μήκους (εκατοντάδες χιλιάδες βάσεις) κάνοντάς τον ιδανικό για πειράματα δομικής γενωμικής. Επιπλέον τα δεδομένα συλλέγονται σε πραγματικό χρόνο.

O αναλυτής SeqStudio Genetic Analyzer (Applied Biosystems) είναι ένα μικρού μεγέθους, 4-capillary, σύστημα τριχοειδικής ηλεκτροφόρησης (Sanger), που χρησιμοποιεί αντιδραστήρια σε κασέτα, παρέχοντας την δυνατότητα για ταυτόχρονη αλληλούχιση και ανάλυση μεγέθους θραυσμάτων DNA.

Η πλατφόρμα Chromium Controller χρησιμοποιεί εξειδικευμένα microfluidics για να  απομονώσει μονήρη κύτταρα (single cell) και να τα κωδικοποιήσει μέσα σε λίγα λεπτά. O Chromium Controller επιτρέπει την ανάλυση μονήρων κυττάρων σε μαζική κλίμακα και σε πολλές διαστάσεις όπως: gene expression, cell surface proteins, immune clonotype, antigen specificity, and chromatin accessibility.

Έλεγχος ποιότητας

Ο έλεγχος ποιότητας των δειγμάτων και των βιβλιοθηκών εκτελείται με το σύστημα 2100 Bioanalyzer το οποίο είναι καθιερωμένο εργαλείο αυτόματης ηλεκτροφόρησης. Το 2100 Bioanalyzer, μαζί με το 2100 Expert Software, παρέχει υψηλής ακρίβειας αναλύσεις διαφόρων τύπων δειγμάτων σε πειραματικές ροές. Ξεκινώντας από ελάχιστη ποσότητα, και σε διάστημα λίγων λεπτών, τα ψηφιακά δεδομένα προσφέρουν αντικειμενική αξιολόγηση μεγέθους, ποσότητας, ακεραιότητας και καθαρότητας σε δείγματα DNA, RNA και πρωτεΐνών.

Η ποσοτική μέτριση των βιβλιοθηκών επιτυγχάνεται επίσης και με το Qubit 4 Fluorometer (Invitrogen). Το Qubit 4 είναι σχεδιασμένο να μετράει με ακρίβεια την συγκέτρωση δειγμάτων DNA, RNA και πρωτεϊνών ενώ το συγκεκριμένο μοντέλο είναι σε θέση να αξιολογίσει την ποιότητα και την ακεραιότητα δειγμάτων RNA.

Specialized computing services

Η μονάδα BiGen διαθέτει ειδικό γραφείο βιοπληροφορικών αναλύσεων, με 4 τερματικά υψηλών επιδόσεων (Linux workstations) και ένα κεντρικό server (2x Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2670 v3 @ 2.30GHz, 128 GB RAM, 2x4TB(raw) HDD in RAID, 1x 200GB(raw) SSD) με εγκατεστημένα και επικαιροποιημένα βιοπληροφορικά εργαλεία και αναλυτικές ροές. Ο Server είναι προσβάσιμος και εξ αποστάσεως ενώ εξειδικευμένο προσωπικό IT φροντίζει για την απρόσκοπτη λειτουργία του. Νέο λογισμικό μπορεί να εγκατασταθεί ανά πάσα στιγμή ενώ δεν υπάρχουν περιορισμοί στην διάθεση των πόρων και της υπολογιστικής ισχύος.